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Biblioteca(s): | Epagri-Sede.
Data corrente: | 10/11/2003
Data da última atualização: | 01/06/2011
Autoria: | MARSCHALEK, R.
Afiliação: | Epagri
Título: | Marker assisted selection for the development of intervarietal substitution lines in rapeseed (Brassica napus L.) and the estimation of QTL effects for glucosinolate content.
Ano de publicação: | 2003
Fonte/Imprenta: | 2003. 121 f.
Idioma: | Inglês
Notas: | Tese (Doutorado em Ciencia agricola) - Georg-August-Universitat zu Gottingern-Germany.

Conteúdo:

Seleção assistida por marcadores para o desenvolvimento de linhas de substituição invervarietais em colza (Brassica napus L.) e estimativa do efeito dos QTL para teor de glucosinolatos (Marschalek R, 2003)   rubensm@epagri.rct-sc.br (Epagri  E.E.Itajaí). Introdução e Revisão de Literatura: A terra tem 4,6 bilhões de anos sendo que há 4,0 bilhões de anos as primeiras moléculas orgânicas iniciavam sua reprodução e os primeiros seres unicelulares surgiam (Welter-Schultes e Krätzner, 1999). No entanto, as plantas com flores apareceram bem mais tarde, entre 80 a 90 milhões de anos (Goth, 2002), durante o cretáceo; já os primeiros hominídeos surgiram na África entre 6 a 7 milhões de anos atrás (Ziegler, 2002; Gibbons, 2002), sendo que o gênero Homo surgiu há 2 milhões de anos (Leakey e Walker, 1997). Os humanos anatomicamente modernos apareceram há 270.000 anos (Allard, 1999; Bräuer, 2003), todavia as economias agrícolas se desenvolveram entre 15.000 e 10.000 anos atrás (Allard, 1999). Os humanos começaram assim a influenciar a evolução, visto que passaram a afetar diretamente algumas espécies durante a domesticação pois o suprimento de suas necessidades implicava na busca de certas características nos vegetais e animais. Assim, por um longo período, e talvez inconsciente e empiricamente, os humanos tenham usado a seleção para obter da natureza aquilo que necessitavam. A história nos prova que o Homo sapiens foi exitoso neste aspecto, e atualmente empregam-se as mais variadas e extraordinárias técnicas a fim de continuarmos persistentemente empenhados na busca pelo alimento. Para desenvolver novos e melhores genótipos na agricultura, é necessário implementar o conhecimento sobre a herança dos caracteres. Neste sentido, dois aspectos são importantes atualmente: a identificação e localização de genes responsáveis pelo controle dos caracteres, e o efeito genotípico e fenotípico dos alelos presentes nestes loci. Estas são duas questões importantes também para a colza (também chamada de ?canola?). A colza (Brassica napus L.) é uma das plantas oleaginosas mais importantes do mundo, representando em 2002 10,1% da área colhida de oleaginosas (Fao, 2003), com uma produção de 31.604.000 toneladas de grãos (Oil World, 2003). Após a extração do óleo, o farelo resultante é uma boa fonte de proteína para ração animal, todavia este contém ainda alguns componentes nocivos à nutrição animal, como os glucosinolatos, tornando a geração de variedades com um menor teor destes compostos um importante e constante alvo no melhoramento desta espécie. Glucosinolatos são metabólicos secundários (Wallsgrove e Bennett, 1995) que contém nitrogênio e enxofre e são encontrados naturalmente em muitas famílias vegetais (Malvaceae, Cucurbitaceae, Brassicaceae, etc) (Wittstock e Halkier, 2002). Os glucosinolatos e as thioglucosidases (mirosinases) são os principais componentes do sistema glucosinolatos-mirosinase, que provê a planta com uma defesa efetiva contra herbívoros generalistas e provavelmente contra patógenos (Bones e Rossiter, 1996; Raybould e Moyes, 2001; Kessler e Bakdwin, 2002; Zhao e Meng, 2003). Os glucosinolatos ocorrem por todos os tecidos vegetais, enquanto as mirosinases estão localizadas em células de mirosina, que parecem estar livres de glucosinolatos (Wittstock e Halkier, 2002). Importa ressaltar que os componentes do sistema encontram-se separados fisicamente até que a autólise ou ferimentos nos tecidos os ponham em contato (Thangstad et al., 2001). Os glucosinolatos são componentes não tóxicos, porém em contato com as mirosinases, são hidrolisados transformando-se em vários compostos biologicamente ativos e tóxicos, entre eles os isothiocianatos. Os efeitos dos glucosinolatos variam de atividades antimicrobianas e preventivas do câncer, até ações inflamatórias e goitrogênicas (Wittstock e Halkier, 2002). Até o momento foram identificados seis QTL para teor de glucosinolatos no cruzamento ?Mansholt? x ?Samourai? (Uzunova et al., 1995; Weißleder, 1996; Fischer e Ecke, 1997; Gül, 2002). Destes, três apresentam efeito maior e três apresentam um efeito menor. Em modernos programas de melhoramento é comum o surgimento de genótipos com teor de glucosinolatos superior ao dos parentais. Assim, um melhor conhecimento a respeito da herança deste caracter é desejável. Buscou-se através deste estudo obter maiores informações sobre a herança em colza, visando especificamente atingir dois objetivos: (a) O primeiro objetivo visou obter material básico para o desenvolvimento de ?linhas de substituição intervarietais?. Estas linhas seriam basicamente constituídas pelo genoma do parental recorrente e segmentos pequenos e bem definidos do parental doador. O conjunto das linhas deveria portanto representar a totalidade do genoma do parental doador e poderia ser no futuro usado para estudos de herança dos glucosinolatos e outros caracteres. (b) O segundo objetivo visou estimar o efeito dos seis QTL mencionados acima, através de experimentos de campo com famílias BC3, que segregariam para um ou dois dos QTL citados. Material e métodos: Iniciou-se com uma população duplo haplóide (151 linhas DH) derivada de um cruzamento entre duas linhas duplo haplóides (DH 5.1 e DH 11.4 respectivamente) obtidas de duas variedades de colza de inverno, ?Mansholt?s Hamburger Raps? e ?Samourai?. A primeira, usada como parental doador, é uma antiga cultivar holandesa, e ?Samourai?, usada como parental recorrente, é uma moderna cultivar francesa. Dez linhas DH, cobrindo todo o genoma do parental doador, foram escolhidas através da seleção assistida por marcadores. Estas dez linhas foram retrocruzadas com Samourai originando plantas BC1, que por sua vez foram novamente retrocruzadas originando 300 plantas BC2. As plantas BC2 foram submetidas à seleção assistida por marcadores (AFLP, SSR e RAPD), sendo que as plantas selecionadas, que cobriam todo o genoma de Mansholt, foram retrocruzadas também com Samourai originando uma população de 300 plantas BC3. Estas foram igualmente analisadas com marcadores selecionando-se um conjunto de indivíduos que representassem a totalidade do genoma doador mapeado. As populações BC2 e BC3 foram obtidas e cultivadas em casa de vegetação mediante fotoperíodo de 16/8 horas (dia/noite) e 18°C. A vernalização ocorreu sob 4°C durante 8 semanas. O cultivo e cruzamentos se deram de 1999 até 2002. Amparados na literatura, esperava-se obter em BC3 os primeiros indivíduos contendo somente um segmento do genoma do parental doador. Estes seriam então autofecundados de modo que se obtivesse indivíduos homozigotos para estes segmentos em BC3F2 (Figura 1). Os genótipos com dois ou mais segmentos seriam então novamente retrocruzados e autofecundados na geração seguinte (BC4 e BC4F2 respectivamente). Os indivíduos homozigotos para os diversos segmentos do parental doador, deveriam então cobrir a totalidade do genoma doador, constituindo-se assim nas linhas de substituição propriamente ditas. Em todos as etapas, a seleção foi feita com base em dois critérios: (a) a seleção dos genótipos deveria priorizar aquele grupo de indivíduos com o menor número possível de fragmentos do parental doador em seu genoma, (b) os segmentos deveriam ser o mais longo possíveis. Para a seleção assistida por marcadores (SAM) extraiu-se o DNA de folhas das plântulas (15-21 dias) utilizando-se o ?Nucleon Phytopure Kit? (Amersham). A grande maioria dos marcadores foram do tipo AFLP, utilizando-se o protocolo original de Vos et al. (1995) com algumas modificações. A restrição foi efetuada utilizando-se as enzimas EcoRI e MseI. As amplificações foram feitas em um termociclador Tgradient (Biometra) e a eletroforese no sequenciador ?DNA Analyser Gene Readir 4200 (Li-Cor®)? (1000 V, 37 mA, 40 W, 45°C) em géis de poliacrilamida 6% (25 cm x 0,2 m x 0,02 mm). A análise codominante de marcadores AFLP foi necessária quando o alelo dominante procedia do parental recorrente, sendo para tanto utilizado o software AFLP-Quantar&#61652; Pro 1.0 (Keygene, 2000). Já com relação ao segundo objetivo do trabalho, isto é, estimar o efeito dos QTL, foram instalados em 2001/2002 dois ensaios de campo visando avaliar o teor de glucosinolatos nas sementes de plantas de polinização aberta. As parcelas constituiam-se de 50 plantas BC3 cada uma. De acordo com os dados moleculares das plantas da geração BC2, foram selecionadas famílias BC3 que continham somente um ou no máximo dois alelos de Mansholt, de um total de seis QTL. Cada planta BC3 foi colhida individualmente (polinização aberta). Para uma planta BC2 que continha somente um alelo, esperava-se naturalmente uma segregação 1:1 na descendência (BC3), isto é, plantas com alto teor de glucosinolatos e plantas com baixo teor de glucosinolatos. As plantas BC3 (sementes das mesmas) foram então avaliadas por NIRS para verificar a existência ou não da segregação. O efeito do QTL nas famílias BC3 que só segregavam para um dos seis QTL, foi calculado a partir da diferença entre as classes fenotípicas decorrentes da segregação. O teor de glucosinolatos foi mensurado através de infravermelhor próximo (NIRS) usando o Foss Tecator 6500 e o software ISI versão 1.04. 
Resultados: Com relação a análise codominante de marcadores AFLP, que significava uma inovação, esta revelou-se como sendo de difícil aplicação originando resultados duvidosos. Os marcadores AFLP provindos do parental recorrente deveriam, num retrocruzamento, originar também uma segregação 1:1 (AA:Aa), porém esta seria visualmente impossível de ser observada. O software AFLP-Quantar&#61652; Pro  pretendia fazer esta distinção quantitativamente, baseado na quantificação da amplificação gerada pelos dois tipos de indivíduos. No entanto, em apenas 26% dos marcadores analisados codominantemente o software conseguiu identificar dois grupos de indivíduos, um com intensidade de banda maior (AA) e outro grupo com intensidade de banda menor (Aa). A figura 2 mostra um dos marcadores analisados com sucesso pelo software. Figura 3 Representação gráfica (software GGT; Van Berloo, 1999) do grupo de ligação n° 8 nas 52 plantas BC2 (16 marcadores). Legenda: Cor preta: segmentos do genoma doador; cinza médio: segmentos do genoma recorrente; cinza claro: segmento de origem desconhecida. Abreviações: mg = grupo de marcadores (marcadores cosegregando). Das 300 plantas BC2 foram selecionadas 20 através de SAM (164 marcadores - AFLP, SSR, RAPD - 130 loci) que permitiram a cobertura de 1.325 cM do genoma da colza. As 20 plantas BC2 selecionadas foram retrocruzadas com a DH11.4 (Samourai) originando 300 indivíduos BC3. Estes foram submetidos a caracterização por 132 marcadores moleculares (120 loci) sendo selecionadas 52, de modo que os segmentos do parental doador destas 52 plantas cobrissem a totalidade do genoma (Mansholt) mapeado (figura 3). No entanto, entre as 52 plantas BC3 não foi possível encontrar alguma que possuísse somente um segmento do parental doador. O conjunto das 300 plantas apresentou de 2 a 13 segmentos do parental doador por planta.
Tabela 1 Efeitos dos QTL para teor de glucosinolatos [µmol/g seed] em diferentes estudos no cruzamento Mansholt x Samourai e valores fenotípicos dos parentais
Figura 4 Distribuição do teor de glucosinolatos na família BC3 2034-2-18 (local: Reinshof) segregando para o QTL no grupo de ligação 16. No que se refere ao segundo objetivo, isto é, estimar o efeito dos seis QTL para teor de glucosinolatos (Tabela 1), o teor de glucosinolatos foi avaliado nos grãos intactos, utilizando-se NIRS (técnicas estereoscópicas de infravermelho próximo) nas 279 famílias BC3 avaliadas. Para os dois QTL de maior efeito, nos grupos de ligação 16 e 18, uma clara segregação 1 : 1 (Figura 4) em duas classes fenotípicas foi observada, o que no entanto não ocorreu com o outro QTL localizado no grupo nove e tampouco nos três QTL de efeito menor. O cálculo do efeito destes QTL, por sua vez, necessitou de um procedimento especial. Nas famílias onde uma clara segregação não pode ser observada, o efeito do QTL foi estimado através da comparação do valor fenotípico médio da família BC3 em questão (z), e o valor fenotípico médio do parental recorrente (y) (Samourai), considerando que ?z? poderia ser calculado pela seguinte equação: ?z=(x + y)/2?. Nesta equação, o valor de ?x? é o valor fenotípico médio da classe heterozigota para o QTL em questão, enquanto ?y? representa o valor fenotípico médio da classe homozigota, que corresponde ao parental Samourai. Assim, estimou-se o fenótipo (valor fenotípico médio) da classe heterozigota através da igualdade ?x = (2z) ? y?, sendo finalmente o efeito do QTL a diferença desta classe para Samourai, ou seja, ?x-y?.
Discussão:
A análise codominante dos marcadores AFLP através do software AFLP-Quantar Pro mostrou-se pouco eficiente. O software baseia-se na premissa teórica de quantificar a amplificação dos fragmentos através da intensidade da ?banda? (Keygene, 2000). O dilema é a confiabilidade nos resultados obtidos, visto que o único modo de confirmar a veracidade dos mesmos seria obtido na próxima geração, fazendo-se a autofecundação dos genótipos analisando-se a segregação ou não nas progênies. Atualmente há raros relatos de sucesso na análise codominante de marcadores AFLP (Castiglioni et al., 1999). 
De acordo com Visscher (1996) apenas 3 ou mais marcadores por cromossomo seriam necessários para explicar toda a variância observada. Na BC3, uma média de 6 loci marcadores estão disponívies por cromossomo, o que gera aproximadamente 6.6 loci por Morgan (120 loci/18 Morgan). Quanto ao número de segmentos, de acordo com a literatura (Cermakova et al., 1999; Howell et al., 1996; Ramsay et al. 1996; Rae et al., 1999), já na geração BC3 seriam esperados genótipos portadores de apenas um segmento do parental doador. Uma análise pormenorizada destes trabalhos revelou no entanto, que isso somente foi possível ignorando-se parte do genoma. Isto significa que com as linhas de substituição desenvolvidas nestes estudos não havia sido possível abranger a totalidade do genoma do parental doador, já neste estudo, a totalidade do genoma mapeado foi considerada. Em função das dificuldades inerentes à análise codominante de marcadores AFLP, sugere-se que dos 52 indivíduos BC3 selecionados, sejam tomados os 26 que têm 4 ou menos segmentos do parental doador, sendo que destes seriam obtidas linhas DH. Estas seriam então analisadas com todos os marcadores AFLP, visto que neste caso não teria-se mais a análise codominante, que seria necessária se o esquema original de (Figura 1) de obtenção das linhas de substituição fosse seguido. Analisadas com marcadores, as linhas duplo haplóides contendo um único segmento do parental doador constituiriam-se nas linhas de substituição propriamente ditas. Quanto ao segundo objetivo do presente estudo, a localização (posição) dos três QTL maiores pôde ser confirmada, uma vez que nas regiões em que foram mapeados (em estudos anteriores), claros efeitos, quanto ao teor de glucosinolatos, puderam ser encontrados nas famílias BC3. Para dois destes QTL uma clara segregação pôde ser obtida, o que possibilita uma precisa localização destes QTL no mapa genético  possibilitando a clonagem dos mesmos. Nas famílias BC3 o efeito do QTL é a soma dos componentes aditivos e de dominância, sendo que efeitos epistáticos não estão excluídos. Quando comparam-se os efeitos dos QTL estimados pelo ?interval mapping? com os obtidos neste estudo através das famílias BC3, conclui-se que efeitos de dominância estão significativamente presentes. Para o QTL do grupo 18 os efeitos aditivos e de dominância praticamente se igualam. Nos outros dois QTL maiores, os efeitos de dominância são maiores do que os aditivos. No que se refere aos QTL menores, efeitos também puderam ser estimados, embora apenas o QTL no grupo de ligação três tenha apresentado um efeito estatísticamente significativo. Efeitos epistáticos foram verificados nas famílias BC3 que apresentavam segregação em dois QTL.
Por outro lado, a soma do efeito dos QTL estimados nas famílias BC3 excede a diferença do teor de glucosinolatos entre os parentais em 9.5 µmol/g. Além disso, analisando-se os F1 entre o cruzamento ?Mansholt? x ?Samourai? Uzunova et al. (1995) e Weißleder (1996) observaram apenas dominância parcial para este caráter. Isso provavelmente indica interações epistáticas que reduzem os efeitos fenotípicos dos alelos de Mansholt quando estes estão presentes em mais de um dos QTL. Tais interações podem portanto ter levado à uma subestimativa (Tabela 1) dos efeitos aditivos no ?interval mapping? visto que muitos dos duplo haplóides têm alelos de Mansholt em mais de um QTL e efeitos de interação não são considerados no modelo para o mapeamento de QTL.

Palavras-Chave: | Brassica napus; Colza; Genotipo; Semente.
Categoria do assunto: | --
URL: | http://intranetdoc.epagri.sc.gov.br/producao_tecnico_cientifica/DOC_2358.pdf
Registro original: | Epagri-Sede (Epagri-Sede)

Exemplares:

Epagri-Sede - (27491-1) - UPC - TS - -- - TES 842/03 -  - 2003.0842 - DIS
Epagri-Sede - (27491-2) - UPC - TS - -- - TES 842/03 -  - 0000.4230 - DIS